CHUV
Les activités du CHUV
MENU
Service
d'immunologie et allergie
Accueil > Research > Plateforme clinique d'immuno-monitorage


L’avenir du monitorage immunologique dans la prise en charge des patients

La mise en place d’une plateforme clinique d’immuno-monitorage au CHUV a comme buts principaux l’identification de profils (ou profilage) immunologiques associés à différents agents infectieux, cancers, maladies auto-immunes ou hématologiques. Le profilage consistera à caractériser les cellules et des tissus au niveau phénotypique, fonctionnel et génétique. Cette caractérisation permet l’association entre le profil immunologique d’un patient et l’apparition de sa maladie. L’établissement d’un profil des cellules immunes ou cancéreuses permettra à moyen terme de prédire l’évolution de la maladie. Les profils peuvent ensuite être comparés entre les cas où la maladie est contrôlée ou récurrente pour identifier les marqueurs biologiques associés avec un meilleur contrôle de la maladie. La plateforme d’immuno-monitorage permettra d’effectuer des études importantes pour identifier les cellules spécifiques ainsi que les mécanismes d’actions associés à une thérapie précise. Avec la méthode de criblage orthogonal en place et en développement, un des principaux buts est également l’indentification de bio-marqueurs immuns qui sont associés avec des réponses efficaces suite à une thérapie. Cette plateforme facilitera la quête de nouvelles découvertes, améliorera le suivi et les chances de succès des traitements et amènera des progrès innovants dans la prise en charge des patients.
 

La plateforme d’immuno-monitorage clinique sera utilisée pour la caractérisation de cellules et de tissus de patients atteints de maladies infectieuses, de cancers, de maladies systémiques inflammatoires, mais aussi de patients transplantés ou immuno-supprimés. Cette plateforme permettra, par exemple, de suivre l’évaluation de la réponse immune aux vaccinations saisonnières contre la grippe dans des populations particulièrement à risque comme les transplantés d’organes, les individus immuno-supprimés ou les personnes âgées. De plus, cette plateforme permettra le suivi de la réponse immunitaire dans le cadre d’études cliniques de phase I/II de vaccins expérimentaux contre des maladies infectieuses telles que la malaria, la tuberculose et le VIH. La plateforme d'immuno-monitorage se propose de mettre à disposition son expertise et ses services aux différents départements du CHUV, en particulier aux départements des laboratoires, de médecine, d’oncologie, de neuroscience et de chirurgie. La plateforme est également un atout dans le projet de la bio-banque institutionnelle lausannoise (BIL) pour soutenir la découverte et le développement de nouvelles thérapies et ainsi positionner Lausanne et le CHUV en tant que centre pour la médecine génomique.
 

La plateforme d'immuno-monitorage atteindra ses objectifs grâce à l’implémentation de techniques établies, ainsi que par la mise en place de nouvelles technologies. Ces technologies comprennent: la cytométrie de flux permettant le phénotypage, ainsi que l’analyse fonctionnelle de cellules vivantes, la technologie Fluidigm permettant l’étude de l’expression des gènes au niveau d’une cellule, ainsi que la caractérisation approfondie de profils phénotypique et fonctionnels grâce à la cytométrie de masse (CyTOF).

Go top

La cytometrie de flux

La plateforme de cytometrie du service IAL/LIA est conforme au standard ISO/CEI 17025 et accréditée à des fins de diagnostics. Une plateforme de cytometrie est aussi disponible au sein du département d’oncologie. Ce service est utilisé pour les patients lors de bilans immunologiques nécessaires dans les cas d’infections virales, cancers, d’immunodéficiences, de typing HLA et de transplantations. Grâce à l’utilisation de panels validés d’anticorps couplés à des fluorochromes et selon le type de cytomètre en flux, jusqu'à dix-huit paramètres différents peuvent être détectés simultanément et ainsi permettre l’évaluation phénotypique et fonctionnelle de la réponse immunitaire au niveau d’une cellule. Ces équipements permettent également de réaliser des tris cellulaires à haut débit, reposant sur des analyses cellulaires multiparamétriques, pour la purification de sous-populations cellulaires d'intérêt. Ces sous-populations pourront ensuite être étudiées pour différents paramètres (transcriptome, protéome, transfert in vivo, ...). Les capacités de tri permettent aussi d'isoler des cellules individuelles en milieu stérile, pour le clonage par exemple. De nombreux réactifs sont disponibles et des profils sont déjà validés pour différentes maladies.

Go top

Le système Fluidigm

L’analyse grâce au système Biomark (Fluidigm) combine la séparation des cellules à l’aide du cytomètre de flux avec des puces à microcircuits intégrés de fluidiques dédiées à la PCR en temps réel, permettant l’analyse en multiplexe de l’expression génique. Lors d’une expérience, un échantillon est marqué à l’aide d’anticorps conjugués à des fluorochromes et les populations spécifiques d’intérêt sont déposées dans les puits individuels d’une plaque à 96 puits. Dans un essai de PCR en temps réel TaqMan 96x96, l’expression de 96 gènes sélectionnés sur la base de leurs rôles dans la réponse immunitaire peut être analysée sur 96 échantillons individuels. Les courbes de PCR en temps réel sont analysées pour chaque cellule/échantillon permettant l’établissement d’un profil d’expression génique pour chaque cellule/échantillon. Les résultats sont représentés en "heat maps" suivant le niveau d’expression des gènes. Des algorithms statistiques de groupement (ou «clustering») sont utilisés pour définir l’association des différentes cellules en différents groupes fonctionnels. Cette technologie est utilisée actuellement dans un projet de recherche IAL pour caractériser les populations parentes des T auxiliaires folliculaires qui représentent le réservoir majeur du virus chez les patients infectés par le VIH.

Go top

 
Go top

La cytométrie de masse

La cytométrie de masse est une technologie émergente qui est nouvellement mise en place par le service IAL/LIA depuis 2013. Cette technique utilise des principes connus de la cytométrie de flux. Cependant, à la place d’anticorps couplés à des fluorochromes, les anticorps utilisés pour cette technique sont couplés à des isotopes de métaux rares, comme par exemple ceux de la série des lanthanides. Les cellules marquées avec les anticorps sont introduites dans un spectromètre de masse couplé à un plasma inductif (ICP-MS) pour une analyse élémentaire. Les avantages principaux de la cytométrie de masse sont 1) la disponibilité d’un grand nombre d’éléments qui peuvent être utilisés pour marquer les différents anticorps, une diversité qui permet de créer de larges "panels" de marqueurs et 2) l’absence de recouvrement de masse entre les isotopes élémentaires utilisés. Ces caractéristiques permettent de mesurer plus de 37 paramètres simultanément sans avoir besoin de compenser entre les différent anticorps couplés à des métaux. En comparaison, une compensation soigneuse entre les différents fluorochromes doit être apportée lors de l’utilisation d’anticorps couplés à des fluorochromes en cytométrie de flux, ce qui limite le nombre de paramètres qui peuvent être mesurés. La capacité à mesurer de multiples paramètres grâce à la cytométrie de masse facilite l’exploration des voies complexes qui existent au sein d’une cellule ou d’une population de cellules. En plus des capacités analytiques de pointe, la communauté de cytométrie de masse est un groupe de scientifiques très coopératifs qui ont développé et continuent de développer des programmes d’analyses très performants. Ces outils sont fondamentaux dans la découverte de relations au plan cellulaire, pour la caractérisation des réponses à une thérapie, ainsi que pour élucider les stades du développement. En plus d’une caractérisation en profondeur des systèmes d’intérêts, les échantillons peuvent être multiplexés permettant ainsi un rendement maximum par échantillon.

Plusieurs études de références ont été publiées récemment montrant les capacités de la cytométrie de masse en tant que nouvelle technologie émergente. Une étude en particulier, publiée par Bendall, Simonds et al. a mis en évidence la réponse du système immunitaire à un traitement conjugué avec une dose-réponse sur l’ensemble du système hématopoïétique de l’humain. Des cellules de la moelle ont été sujettes à 22 conditions différentes et analysées à l’aide de 18 marqueurs fonctionnels liés aux voies de signalisation cellulaires et 13 marqueurs de surface pertinents pour le système immunitaire. Cette étude fournit un profil fonctionnel exhaustif pour l’entier du système hématopoïétique humain et démontre que les effets d’une drogue peuvent être spécifiques au traitement, mais aussi agir spécifiquement sur un groupe de cellules. Ces expériences montrent qu’il est possible de prédire l’efficacité d’une intervention pharmacologique dans un modèle de maladie pour laquelle les mécanismes inflammatoires sont connus.

Des études additionnelles ont été menées dans les laboratoires du Prof. Neel et du Prof. Nolan. Ils ont analysé 40 échantillons de tumeurs primaires isolées de patients atteints d’un cancer de l’ovaire. À la suite d’un criblage à haut débit par cytométrie de flux pour définir les marqueurs de surface pertinants, les échantillons ont été analysés par cytométrie de masse. L’étude s’est concentrée sur l’identification des mécanismes provoquant une résistance au traitement. Dans le cancer de l’ovaire, 70-90% des patients qui répondent initialement au traitement standard développent une résistance médicamenteuse entrainant la mort. Deux modèles ont été proposés pour expliquer l’émergence de tumeurs résistantes à la thérapie. Soit un modèle stochastique où les cellules tumorales se renouvellent indéfiniment jusqu’à l’acquisition de mutations les rendant résistantes au traitement, soit un modèle de cellules souches où une sous-population de cellules est responsable pour la croissance de la tumeur. Les études en cytométrie de masse ont montré que certaines sous-populations de cellules tumorales ont une sensibilité différente aux agents de chimiothérapie, supportant le modèle des cellules souches. La cytométrie de masse permet le profilage approfondit des populations, la caractérisation de leurs attributs, leurs fonctions, ainsi que leurs réponses à différents traitements. En conséquence, ces études sont capables d’identifier les thérapies qui ciblent préférentiellement les cellules souches, permettant à moyen terme de diminuer le taux de morbidité et de mortalité lié à ces différents types de cancers gynécologiques.

Go top

L’analyse de ces sets de données multidimensionnelles ne serait pas envisageable sans le développement d’algorithmes d’analyses tels que SPADE (Spanning tree Progression of Density normalized Events). SPADE est utilisé pour extraire des hiérarchies cellulaires et permet la visualisation en deux dimensions de toutes les lignées cellulaires du système immunitaire sur la base de l’expression de marqueurs de surface. Des programmes permettant l’analyse des données sont à disposition sur Cytobank. Cytobank est un site indispensable pour permettre l’analyse des données générées en cytometrie de masse.
 

La plateforme d’immuno-monitorage clinique de l’IAL, (flow cytométrie, Fluidigm et cytométrie de masse) permettra l’analyse compréhensive et approfondie d’échantillons de patients. Ces technologies ont différents avantages qui se combinent permettant un profilage nécessaire pour soutenir le développement de nouveaux tests de diagnostiques et d’essais cliniques, mais aussi les activités du centre de transplantation ainsi que la recherche fondamentale, clinique et transrationnelle. Les avantages de cytométrie de flux incluent l’analyse phénotypique et fonctionnel de cellules vivantes jusqu’à 18 paramètres ainsi que des capacités de diagnostic applicable à de nombreux types de maladies. Le système Fluidigm apporte un profil transcriptionnel de 96 gènes au niveau d’une cellule, qui peut être utilisé pour étudier un large spectre de maladies, ainsi que la réponse transcriptionnelle de différents groupes cellulaires à des médicaments. La cytométrie de masse est une nouvelle technologie qui sera appliquée pour le monitorage du système immunitaire permettant une analyse multi-paramétrée de marqueurs de surface et des voies de signalisations. Le multiplexage permet le profilage de la réponse du système immunitaire aux différentes thérapies médicamenteuses et d’être un outil permettant l’ouverture de nouvelles voies pour le pronostic de traitement de diverses maladies. Ensemble, ces méthodes d’analyses qui composent la plateforme d’immuno-monitorage permettrons le profilage approfondi dans les domaines de l’immunologie, des maladies infectieuses, des maladies auto-immunes ou encore de l’oncologie.
 

Le Service d'immunologie et allergie (départements DL et DM) et le département d’oncologie vont travailler ensemble au développement de la plateforme immuno-monitoring, afin de soutenir l’amélioration de la prise en charge des patients pour une thérapie plus efficace et une qualité de vie améliorée.

Go top